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蛋白濃度測定及常用方法

來源: 中國農業儀器網  類別:技術文章  更新時間:2009-06-09  閱讀

蛋白質溶液濃度測定方法有多種,下述幾種方法可供選用。蛋白質濃度的測定,往往用于計算純化方法的回收率的重要方法。

一、蛋白濃度的直接測定(UV法)

這種方法是在280nm波長,直接測試蛋白。選擇Warburg 公式,光度計可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應的換算方法,將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單,先測試空白液,然后直接測試蛋白質。從而顯得結果很不穩定。蛋白質直接定量方法,適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對于比色法來說,速度快,操作簡單;但是容易受到平行物質的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高。

二、比色法蛋白濃度測定蛋白質通常是多種蛋白質的化合物,比色法測定的基礎是蛋白質構成成分:氨基酸(如酪氨酸,絲氨酸)與外加的顯色基團或者染料反應,產生有色物質。有色物質的濃度與蛋白質反應的氨基酸數目直接相關,從而反應蛋白質濃度。

一、雙縮脲法雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法,至今仍廣泛采用。在需要快速,但不很準確的測定中,常用此法。雙縮脲法的原理是Cu2+與蛋白質的肽鍵,以及酪氨酸殘基絡合,形成紫藍色絡合物,此物在540nm波長處有最大吸收。雙縮脲法常用于0.5g/L~10g/L含量的蛋白質溶液測定。干擾物有硫醇,以及具有肽性質緩沖液,如Tris、Good緩沖液等。可用沉淀法除去干擾物,即用等體積10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白質,然后棄去上清液,再用已知體積的1m NaOH溶解沉淀的蛋白質進行定量測定。

三、BCA(Bicinchoninine acid assay)法

這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應產生Cu+,后者與BCA形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關系極強,反應后形成的化合物非常穩定。相對于Lowry法,操作簡單,敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質之間以及去污劑干擾。

四、Lowry法

此法是雙縮脲法的進一步發展。他的第一步就是雙縮脲反應,即Cu++與蛋白質在堿性溶液中形成絡合物,然后這個絡合物還原磷鉬磷-磷鎢酸試劑(福林-酚試劑),結果得到深藍色物。此法比雙縮脲法靈敏得多,適合于測定20mg/L~400mg/L含量的蛋白質溶液。其干擾物質與雙縮脲法相同,要注意的是,加入福林試劑時要特別小心,試劑只在酸性pH環境中才穩定,上述提到的還原反應只有在pH10時才發生,因此,福林試劑加入到堿性的Cu2+-蛋白質溶液中時,必須立刻攪拌,以使磷鉬酸-磷鎢酸試劑在未被破壞之前能有效地被Cu2+-蛋白質絡合物所還原。

試劑:1.試劑 A: 2% Na2CO3/0.1 N NaOH.(Na2CO310g, NaOH 2g 用蒸餾水稀釋至500毫升)。
2.試劑B:Ba : 1% CuSO4˙5H2OBb : 2% 酒石酸鉀鈉(分別配制并存放于棕色瓶內,用時勿搖起沉淀。)
3.試劑C:將 Ba 0.1ml 與 Bb 0.1ml 混勻后,再加A 10ml 4.Folin – Ciocalten 試劑:用前與水1:1稀釋。5.BSA:蛋白標準液 1mg/ml:10mg 結晶小牛血清蛋白加于5ml蒸餾水的10ml 容量瓶表面,待溶,勿劇搖起泡,用蒸餾水小心沖洗至刻度10ml

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