蛋白質是構成生物體細胞組織的重要成分。食物中的蛋白質是人體中氮的惟一來源, 具有糖類和脂肪不可替代的作用。蛋白質與營養代謝、細胞結構、酶、激素、病毒、免疫、物質運轉和遺傳等密切相關, 其分離與定性、定量分析是生物化學和其他生物學科、食品檢驗、臨床檢驗、診斷疾病、生物藥物分離提純和質量檢驗中最重要的工作。隨著分析手段的不斷進步, 對食品中蛋白質含量的測定方法也正向準確和快速的方向發展。

目前, 測定食品中蛋白質含量的方法有多種, 一般可分為間接方法和直接方法。間接方法是通過測定樣品中蛋白質的含氮量進行推算蛋白質含量的方法; 直接方法則是根據蛋白質的物理和化學性質, 直接測定蛋白質含量的方法。多年來, 利用蛋白質的主要性質( 如含氮量、肽鍵、折射率等) 和蛋白質含有的特定氨基酸殘基( 如芳香基、酸性基、堿性基等) 來測定蛋白質含量的方法不斷發展, 主要有凱氏定氮法( 國際經典測定方法) 、分光光度法和滴定法等。所用到的儀器有凱氏定氮儀，也叫做蛋白質測定儀。

1.1 凱氏定氮法

測定蛋白質最常用的方法是凱氏定氮法, 它是測定試樣中總有機氮最準確和最簡單的方法之一, 是被國內外作為法定的標準檢驗方法。凱氏定氮法測定蛋白質分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定過程。在催化劑作用下, 試樣用濃硫酸消煮破壞有機物, 使其中的蛋白質氮及其他有機氮轉化為氨態氮, 然后與硫酸結合生成硫酸銨, 加入強堿進行蒸餾使氨逸出, 用硼酸吸收后, 再用酸滴定, 測出含氮量, 將結果乘以換算系數, 計算出粗蛋白質含量。然而該方法存在消化時間太長, 會產生有毒有害氣體, 因此必須在通風櫥中進行的弊端。宗留香等人對這一傳統方法進行了改進, 即用Se 粉作催化劑進行消化, 不用通風櫥, 即實現了環保消化, 并提高了消化效率。

1.2 光度法

光度法分為考馬斯亮藍G- 250 法、雙縮脲法、Folin 酚法( Lowry 法) 、BCA 法和紫外吸收法。

1.2.1 考馬斯亮藍G- 250 法

考馬斯亮藍G- 250 與蛋白質結合反應十分迅速而且穩定, 反應2 min 左右即達到平衡, 其結合物可在室溫下1 h 內保持穩定。考馬斯亮藍G- 250 法是目前靈敏度最高的蛋白質測定方法, 其最低蛋白質檢測量可達1 μg, 比Folin 酚法的的靈敏度高約4 倍,這是因為蛋白質與染料結合后產生的顏色變化很大,蛋白質—染料復合物有更高的消光系數, 因而光吸收隨蛋白質濃度的變化比Lowry 法要大得多。該法方法簡便, 易于操作, 所用試劑較少, 顯色劑易于配制; 干擾物質少, 如糖、緩沖液還原劑和絡合劑等均不影響顯色。

1.2.2 雙縮脲法

雙縮脲法對白蛋白、紅蛋白產生的顏色反應相近, 不受溫度影響, 可快速測定蛋白質含量, 但靈敏度低, 測定范圍為1~20 mg 蛋白質, 適用于精度要求不高的蛋白質含量的測定, 常用于谷物蛋白質含量測定。三羥甲基氨基甲烷和一些氨基酸、EDTA 等會干擾該反應。李寧對凱氏定氮法、考馬斯亮藍法和雙縮脲法進行了比較, 得出結論為, 凱氏定氮法、雙縮脲法和考馬斯亮藍染色法都可以測出被測的全部5 種樣品的蛋白質含量, 其中凱氏定氮法是目前分析有機化合物含氮量常用的方法, 是一種蛋白質測定的經典方法,適用樣品廣泛和用于結果要求準確的測試; 雙縮脲法和考馬斯亮藍染色法的測試過程簡便、迅速, 用于可以準確配取標準蛋白溶液而準確性要求不高的測試中。可以根據含氮量的不同選擇以上兩種方法。

1.2.3 Folin 酚法

Folin 酚法是雙縮脲法的發展, 它結合了雙縮脲試劑和酚試劑與蛋白質的反應。Folin 酚法廣泛應用于水溶性蛋白質含量的測定。Folin 酚法的靈敏度比雙縮脲法高100 倍, 肽鍵顯色效果增強, 減少了因蛋白質種類引起的偏差。該法由于兩步呈色反應可以疊加, 其靈敏度特別高, 所以適用于20~250 μg 微量蛋白質的測定, 可檢測的最低蛋白質量為5 μg。

1.2.4 BCA 法

BCA 蛋白質檢測試劑是當前比Lowry 法更優越的專用于檢測總蛋白質含量的產品, 該法快速靈敏、穩定、可靠, 且對不同種類蛋白質的變異系數甚小, 可檢測到的蛋白質量為0.5 μg, 是目前已知的最靈敏的蛋白質檢測試劑之一。

1.2.5 紫外吸收法

紫外吸收法簡便、靈敏、快速, 不消耗樣品, 低濃度鹽類不干擾其測定。該法的缺點是測定與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質時, 有一定的誤差。紫外吸收法適用于測試無色樣品, 對于有色樣品, 需進行預處理, 排除顏色干擾后才適用于此方法。另外核酸在紫外區也有強吸收, 但通過校正可以消除。

在蛋白質測定中, 光度法應用最多, 適用較廣,對該類方法的研究較深入并不斷被發展。有機染料結合分光光度法測定蛋白質, 操作簡便, 比較靈敏, 一般實驗室條件均能滿足檢測要求,近年來國內外對該類方法的研究應用備加重視。該類方法的基本原理是在酸性介質中, 蛋白質的肽鍵和N端氨基質子化成陽離子, 由于電荷作用, 蛋白質與陰離子染料結合沉淀或改變結合染料的光吸收特性, 由染料顏色的減退或變化的程度來測定蛋白質的含量。考馬斯亮藍G- 250 染料已被廣泛應用; 橙紅G、溴甲酚綠、埃鉻青R、溴酚藍、酸性品紅等染料也已被用于蛋白質測定; 偶氮胂K、偶氮胂Ⅲ、偶氮胂M、硝基磺酚C、硝基磺酚S、氯磺酚K、氯磺酚S、茜紅素S、變色酸2C、變色酸2B、曙紅Y等染料測定蛋白質的分光光度法研究均有報道。

近幾年利用金屬離子和有機染料形成配合物體系, 結合光度法測定蛋白質含量的方法得到了發展。金屬離子與含有- OH 或C=O 的有機染料相遇時, 氧原子中的孤對電子可順利進入雜化軌道, 形成穩定的配合體系, 在酸性條件下, 該體系遇到結構不對稱的蛋白質分子時, 互相極化產生靜電作用而組合成新的大分子團, 改變了原體系的廣譜性能, 從而能定量測定蛋白質的含量。此類方法具有靈敏度高, 線性范圍廣, 干擾離子少, 操作簡單、快速及適于常規應用等特點。金屬離子—有機染料結合分光光度法測定蛋白質含量的發展很快, 如Cu ( II- 氯磺酚S 配合物、Cu ( II) —偶氮胂K 等。熒光光度法用于蛋白質定量測定是近年逐漸興起的新方法, 利用反應物的熒光強度隨蛋白濃度的增加而增加的現象進行蛋白質測定, 并具有工作曲線的線性范圍窄和檢出限高的特點。用于熒光光度法的試劑有吖啶橙、茜紅素S、曙紅Y 和燦爛甲酚藍等。

1.3 滴定法

1.3.1 甲醛滴定法( 指示劑滴定法)

該法節省試劑, 分析速度快, 操作簡便易行。劉玉蘭等人分別用甲醛滴定法和凱氏定氮法測定棉籽餅、大豆、花生、小麥、玉米和蠶豆等蛋白質含量,結果基本一致, 偏差小于0.20。

1.3.2 pH 滴定法

pH 滴定法是指酸堿滴定至某一指定pH 值時,根據滴定劑用量和有關公式計算被測物濃度或含量的方法。它是在水溶液中直接滴定極弱酸堿的最新方法。該方法必須確定合適的pH 值。張大倫等人以玻璃電極為指示電極, 飽和甘汞電極為參比電極, 測定了大豆和花生的蛋白質含量, 結果與傳統凱氏定氮法的測定結果相一致。

1.3.3 甲醛改進滴定法

馬美范和黃曉東將甲醛滴定法和pH 滴定法相結合, 根據甲醛法的原理, 以pH 計替代指示劑指示滴定終點。當銨離子與甲醛迅速反應時放出同物質量的酸, 生成的酸用氫氧化鈉標準溶液滴定, 用電位滴定計指示化學計量點, 根據消耗的氫氧化鈉標準溶液用量計算出蛋白質含量。運用該法測定蛋白質時,待測液必須是中性, 中和時必須嚴格控制溶液的pH 值, 以免銨鹽分解引起誤差。HCHO 可被空氣氧化為甲酸, 宜臨用前配制。該法所獲結果與凱氏定氮法無顯著差異。

2 結束語

以上幾種蛋白質常用的測定方法中, 最經典的是凱氏定氮法, 但是這種方法需要自動或半自動的凱氏定氮儀, 這些儀器價格比較昂貴, 且需要專門的試劑, 因此較難普及。現在已有一些學者對其進行改進研究。在科研檢測工作中, 用戶可根據具體情況選用適宜的、較常用的這些測定蛋白的方法。